La luminescence d'une matière excitée par un rayonnement est appelée fluorescence. La matière fluorescente n'absorbe qu'une partie de l'énergie du rayonnement, de sorte que la partie restante peut être émise avec une énergie plus faible, c'est-à-dire une longueur d'ondes plus élevée. La fluorescéine isothiocyanate (FITC) est le réactif le plus souvent utilisé ; la FITC est excitée par la lumière d'une longueur d'ondes entre 450 et 500 nm (bleu) et émet de la lumière fluorescente de plus faible énergie avec une longueur d'ondes entre 500 et 550 nm.
Les microscopes à fluorescence utilisent des filtres sélectifs qui ne laissent passer vers l'échantillon fluorescent que la lumière d'une longueur d'ondes choisie (par exemple 470 nm) ; inversement, un filtre dichromique et un filtre de bande passante ne dirigent vers l'observateur que la lumière d'une longueur d'ondes entre 520 et 550 nm.
L'immunofluorescence directe se sert d'anticorps marqués par le réactif fluorescent, alors que F immunofluorescence indirecte s'appuie sur un anticorps secondaire marqué par un fluorochrome pour révéler la fixation de l'anticorps primaire spécifique de l'antigène. L'immunofluorescence directe permet de détecter deux antigènes ou plus simultanément. En revanche, l'immunofluorescence indirecte possède une sensibilité supérieure pour la détection d'antigènes faiblement exprimés, puisque plusieurs molécules de l'anticorps secondaire peuvent se lier à une molécule d'anticorps primaire. La membrane cellulaire peut être perméabilisée par fixation afin de permettre la détection d'antigènes cytosoliques. L'immunofluorescence est également utilisée pour l'analyse de cellules en suspension, de sections de tissus ou de préparations obtenues à l'aide de cytocentrifugeuses.
Dans un cytomètre de flux, les cellules sont d'abord mises en suspension monocellulaire dans une chambre à flux en vibration, puis passées à travers un rayon laser sous forme de gouttes. La dispersion de la lumière laser est mesurée par des photomultiplicateurs. La dispersion en avant de la lumière est corrélée à l'taille des cellules, alors que la dispersion latérale (mesurée dans un angle de 90°) correspond de la granulosité et au rapport cytosol/noyau des cellules. On peut ainsi distinguer les grande cellules avec un rapport cytosol/noyau élevé et un cytoplasme granuleux (granulocytes) des petites cellules ayant un noyau de grande taille (lymphocytes). Les monocytes montrent un phénotype intermédiaire.
Au sein des fractions cellulaires ainsi délirantées, la fluorescence peut être mesurée; dans un même échantillon, on peut par exemple évaluer l'immunofluorescence des lymphocytes et des monocytes. L'intensité de la fluorescence est assez bien correlée à la densité de l'antigène à la surface cellulairî et est mesurée par des photomultiplicateurs (D.l.).
La méthode xrmet de se servir simultanément de plusieirs anticorps dirigés contre des antigènes différents et couplés à des fluorochromes différents, tels que la FITC et la phycoérythrine (PE). Ces deux reactifs sont excités par une lumière aser d'une longueur d'ondes de 588 nm mais (mettent des lumières fluorescentes de longueurs d'ondes différentes (lumière verte pour BTC, lumière rouge pour PE). Une telle analys; permet ainsi de distinguer par exemple les populations cellulaires exprimant les deux antigènis (émettant de la lumière rouge ainsi que verte),de celles exprimant un seul des antigènes (lumiire rouge ou verte) et enfin de celles n'exprimant aucun antigène.